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目前,几乎在人体的每个组织中,都发现有干细胞的存在。这些原位的组织干细胞在维持 组织细胞的再生和修复过程中,发挥了重要作用。然而,由于数量少,分离纯化困难,限制了 它们在临床的推广应用。在人的脐血中主要有 CD34+造血干细胞(hematopoietic stem cell, HSC)、间充质干细胞 (mesenchymal stem cell, MSC)和脐血多能干细胞( cord blood-derived multipotent stem cell, CB-SC)。其中 CB-SC 是人脐血中一群独特的干细胞类型,具有大而圆的 形态,贴壁生长,且抵抗常规的细胞消化处理方法(胰蛋白酶/ EDTA 法)具有独特的生物学 特性,作为本章介绍的重点。


第一节 脐血多能干细胞的生物学特性

一. CB-SC 的分子表型特征

CB-SC 表达胚胎干细胞标志(如转录因子 OCT3/4,Nanog,和 Sox2 及细胞表面标志 SSEA-3 和 SSEA-4)和白细胞共同抗原 CD45,但不表达如下血细胞标志,如 CD1a, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD19, CD20, CD34, CD41a, CD41b, CD83, CD90, CD105 和 CD133(均为阴性)。脐血多能干细胞(CB-SC)是脐血中独特的一种新型干细胞: 不同于 单核/巨噬细胞和间充质干细胞(表 1) [1]。

 
表 1.CB-SC 的分子表型不同于单核/巨噬细胞和间充质干细胞。 

表 1.CB-SC 的分子表型不同于单核/巨噬细胞和间充质干细胞。 

 

二. CB-SC 的分子免疫学特征及免疫调节特性:

CB-SC 表达非常低水平的 I 类主要组织相容性复合体抗原(HLA-I); II 类主 要组织相容性复合体抗原(HLA-II)阴性。同种异体淋巴细胞刺激增殖实验表明: CB-SC 具有非常低的免疫原性 [2-4]。正因如此,临床采用 Stem Cell Educator 治疗时,无需进行 HLA 配型,没有排斥反应。另外,CB-SC 细胞表面表达程序化死 亡配体-1(Programmed Death Ligand-1, PD-L1,CD274),通过淋巴细胞表面的 程序化死亡-1(Programmed Death-1, PD-1)结合,对淋巴细胞产生抑制作用 [3]。CB-SC 表达 CD270(Herpes Virus Entry Mediator,HVEM) [5],可通过其配 体 BTLA( B and T lymphocyte attenuator)对多种免疫细胞发挥调节作用 [5]。

胸腺作为人体的中枢免疫器官,是 T 细胞分化成熟的关键部位, 其中胸腺髓 质上皮细胞通过自身免疫调节因子(Autoimmune Regulator, AIRE),调控自身抗 原的表达而删除自身反应性 T 细胞,在诱导免疫耐受方面发挥了关键作用 [6,7]。 但从青少年期开始,胸腺逐渐萎缩并脂肪化,功能减退。重要的是,CB-SC 表达转 录因子自身免疫调控因子 AIRE。临床和基础研究揭示,CB-SC 通过 AIRE 的表达, 在其免疫教育治疗过程中,发挥了关键作用 [1,8],是临床控制自身免疫、诱导免 疫平衡的关键因素 [8]。

三. CB-SC 的多向分化特性:

CB-SC 除了表达胚胎干细胞特异的转录因子外,还具有胚胎干细胞多向分化潜 能(图 1)。在不同诱导条件下,能够分化为三个胚层来源的细胞 [4],例如经过 全反式维甲酸(All trans-retinoic acid, ATRA)处理后,CB-SC 可向多巴胺神 经细胞分化 [9];采用神经生长因子(Nerve growth factor, NGF)处理,CB-SC 可分化为神经细胞 [2]。另外,CB-SC 表达胰岛细胞特异的转录因子 MafA 和 Nkx 6.1,体外经过 10 nM Exendin-4 和 25 mM 高糖刺激,可诱导 CB-SC 向胰岛素产生 细胞分化,进而表达胰岛细胞的分子特征 [4]。

 
脐血多能干细胞的多向分化功能 (The Multiple Differentiation of CB-SCs)。(A)CB-SCs 向神经细胞和少突胶质细胞分化。 CB-SC 分别用 100 ng / ml 的神经生长因子处理 10-14 天,采用神经细胞特异的分子标志检测,表达氨基丁酸(-aminobutyric acid, GABA), 微管相关蛋白(microtubule-associated protein, MAP)1B,突触素(synaptophysin, Synap),硫脂 (sulfatide) O4,髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP),半乳糖 (galactocerebroside, GALC)。 (B)分化为心肌细胞。采用 3 μM 的 5-氮杂-2'脱氧胞苷处 理 CB-SC,24 小时用心肌标记物包括核转录因子的 Nkx2.5,心肌特异性肌动蛋白和肌钙蛋 白 I 检测。(C)向巨噬细胞分化。 CB-SC 经过 50 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF 处理 7-10 天,然后用巨噬细胞特异的荧光珠吞噬作用和表面标记的 CD11b / Mac-1 检测。 (D)向 巨核细胞分化。 CB-SC 分别用 10 ng / ml 的血小板生成素 TPO 处理 10-14 天,表达巨核细胞特 异性标记物 CD41b 和多倍体核(红色箭头)。 (E)分化为血管内皮细胞。 CB-SC 经过 50ng / ml 血管内皮生长因子 VEGF 处理,10-14 天后采用其特异的分子标记物 CD146 和乙酰化低密 度脂蛋白(Ac_LDL)的掺入确定细胞分化。 (F)分化为胰岛素分泌细胞。 CB-SC 均采用 10 nM exendin- 4 + 25 mM 葡萄糖为 5-8 天,可形成“胰岛样”结构,表达胰岛 β 细胞特异 的标记物胰岛素和 GLUT2。

脐血多能干细胞的多向分化功能 (The Multiple Differentiation of CB-SCs)。(A)CB-SCs 向神经细胞和少突胶质细胞分化。 CB-SC 分别用 100 ng / ml 的神经生长因子处理 10-14 天,采用神经细胞特异的分子标志检测,表达氨基丁酸(-aminobutyric acid, GABA), 微管相关蛋白(microtubule-associated protein, MAP)1B,突触素(synaptophysin, Synap),硫脂 (sulfatide) O4,髓磷脂碱性蛋白(myelin basic protein, MBP),半乳糖 (galactocerebroside, GALC)。 (B)分化为心肌细胞。采用 3 μM 的 5-氮杂-2'脱氧胞苷处 理 CB-SC,24 小时用心肌标记物包括核转录因子的 Nkx2.5,心肌特异性肌动蛋白和肌钙蛋 白 I 检测。(C)向巨噬细胞分化。 CB-SC 经过 50 ng/mL 巨噬细胞集落刺激因子 M-CSF 处理 7-10 天,然后用巨噬细胞特异的荧光珠吞噬作用和表面标记的 CD11b / Mac-1 检测。 (D)向 巨核细胞分化。 CB-SC 分别用 10 ng / ml 的血小板生成素 TPO 处理 10-14 天,表达巨核细胞特 异性标记物 CD41b 和多倍体核(红色箭头)。 (E)分化为血管内皮细胞。 CB-SC 经过 50ng / ml 血管内皮生长因子 VEGF 处理,10-14 天后采用其特异的分子标记物 CD146 和乙酰化低密 度脂蛋白(Ac_LDL)的掺入确定细胞分化。 (F)分化为胰岛素分泌细胞。 CB-SC 均采用 10 nM exendin- 4 + 25 mM 葡萄糖为 5-8 天,可形成“胰岛样”结构,表达胰岛 β 细胞特异 的标记物胰岛素和 GLUT2。

 

第二节 脐血多能干细胞的免疫调节特性

近年来,研究发现干细胞除了具有分化特性外,还具有免疫调节特性。干细胞 的免疫调节已成为目前免疫学重要的研究领域之一。特别是针对人类自身免疫性疾 病,希望通过干细胞的免疫调节治疗开辟一条新的途径。效应性 T 细胞的增殖是自 身免疫性疾病共同病理生理特征,因此能够安全有效的抑制 T 细胞的增殖是临床治 疗自身免疫病的关键,也是临床评价各种免疫治疗安全性和有效性的金标准。传统 的化疗、放疗、和单克隆抗体介导的免疫治疗常常具有明显的副作用,病人难以长 期耐受。动物实验和临床体内外研究证明:脐血多能干细胞对多种 T 细胞亚群具有 明显的抑制作用,不仅可以显著抑制丝裂原 PHA 和 IL-2 刺激的淋巴细胞增殖 [3],而且对特异性病理性 T 细胞也有抑制作用 [4,5]。

一、脐血多能干细胞抑制抗原特异性 T 细胞克隆的增殖

抗原特异性自身反应性 T 细胞的扩增是导致自身免疫性疾病组织破坏的关键一 步。最近,小鼠和人的数据表明,CD8+ NKG2D+效应 T 细胞在自身免疫引起的斑秃 (Alopecia Areata,AA)发病过程中发挥了关键作用 [10]。为探讨 CB-SC 在 AA 的 治疗潜力,采用人外周血单个核细胞(PBMC)来源的 CD8+ NKG2D+效应性 T 细胞, 通过磁珠结合的抗 CD3、抗 CD28、和抗 CD137 单克隆抗体的联合刺激,同时加入细 胞因子 IL-2 和 IL-7 扩增 CD8+ NKG2D+效应性 T 细胞;刺激后 T 细胞显著的增殖,5 天后有大量的细胞增殖,聚集成群,具有不同大小尺寸,浮在上清液中(图 2A, 左面)。然而,这种增殖现象在与 CB-SC(图 2A,右图)共培养条件下并不明 显。CFSE 标记后流式细胞术分析显示:采用 mAb 分子和生长因子联合刺激后淋巴 细胞有 52%(图 2B,中图)显著增殖;相比之下, CB-SC 共培养后只有 13%的 淋巴细胞(图 2B,右图)增殖。三重标记流式细胞仪分析表明:在没有 CB-SC 作 用条件下,25%的 CD8+ NKG2D+ T 细胞进行增殖;然而,在 CB-SC 共培养条件下, 增殖的 CD8+ NKG2D+ T 细胞的百分比降低至 5%。另外,我们检测了 BTLA(B and T lymphocyte attenuator)和 PD-1(Programed death-1,程序性死亡受体-1)共抑 制分子的表达在 CD8+ NKG2D+ T 细胞表达。结果证实: CB-SC 共培养可显著增加 CD8+ NKG2D+ BTLA+ PD1+ T 细胞的百分比从 69%至 91%。他们的平均荧光强度 (MFI)共培养后(图 2C,右图)也明显增加。这些数据表明,CB-SC 能显着抑制 的 CD8+ NKG2D+ T 细胞的增殖和上调细胞共抑制分子的表达 [5]。

 
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图 2.体外 CB-SC 对 T 细胞的免疫调节研究。(A)相差显微镜显示细胞团形成。人外周血 来源的淋巴细胞经过与磁珠结合的抗 CD3、抗 CD28、抗 CD137 抗体、50U / ml 的重组 IL- 2 和 5 ng/ml 重组 IL-7 刺激 5 天,形成大量细胞团(左图);但和 CB-SC 共培养后,淋巴细胞单个存在没有细胞团的形成(右图)。原始的放大倍率,100。(B)采用 CellTraceTMCFSE 细胞增殖试剂盒分析细胞增殖。未经处理的淋巴细胞(左图)作为对照。 (C)多色流式细胞仪分析 CD8+ NKG2D+ T 细胞。选择的 CD8+ NKG2D+ T 细胞用于共抑制分 子 BTLA 和 PD-1 的表达水平的进一步分析。同型匹配的 IgG 抗体作为阴性对照。

图 2.体外 CB-SC 对 T 细胞的免疫调节研究。(A)相差显微镜显示细胞团形成。人外周血 来源的淋巴细胞经过与磁珠结合的抗 CD3、抗 CD28、抗 CD137 抗体、50U / ml 的重组 IL- 2 和 5 ng/ml 重组 IL-7 刺激 5 天,形成大量细胞团(左图);但和 CB-SC 共培养后,淋巴细胞单个存在没有细胞团的形成(右图)。原始的放大倍率,100。(B)采用 CellTraceTMCFSE 细胞增殖试剂盒分析细胞增殖。未经处理的淋巴细胞(左图)作为对照。 (C)多色流式细胞仪分析 CD8+ NKG2D+ T 细胞。选择的 CD8+ NKG2D+ T 细胞用于共抑制分 子 BTLA 和 PD-1 的表达水平的进一步分析。同型匹配的 IgG 抗体作为阴性对照。

 

 

二、脐血多能干细胞抑制人胰岛β细胞特异的 T 细胞克隆的增殖

自身免疫性疾病如 T1D 其病理特点具有相对特异性,主要损伤产生胰岛素的胰 岛β细胞。这些特异性的病理性 CD4+ T 细胞和 CD8+ T 细胞,可以通过 MHC tetramer 标记克隆筛选从患者的外周血液中分离纯化出来。为了进一步确定 CB-SC 在 1 型糖尿病(T1D)的治疗潜力,我们探索了 CB-SC 对从 T1D 患者血液分离产生 的胰岛β细胞谷氨酸脱羧酶(GAD)特异性 CD4+ T 细胞克隆的直接调制。结果表 明:经过抗原呈递细胞(APC)和不同剂量的 GAD 肽的联合刺激后,T 细胞克隆的 显著增殖,但与 CB-SC 共培养后,T 细胞的增殖显著受到抑制,与对照组相比具有 显著差异 [4]。因此,该数据表明,CB-SC 可以直接抑制病理性特异性 T 细胞。

三、脐血多能干细胞的免疫教育治疗技术 (Stem Cell Educator Therapy)

利用 CB-SC 的上述免疫调节特性,表达自身免疫调控因子(AIRE) [8],改变 调节性 T 细胞(Treg)和对人胰岛细胞特异性 T 细胞克隆的直接抑制作用 [4,11],我们创建了这种全新的自体血免疫细胞教育治疗技术(Stem Cell Educator therapy)(图 3)(ClinicalTrial.gov:NCT01415726) [8]。

治疗过程如图 3 所示。简要的说,一个 16 或 18 号针放置在左或右侧肘正中静 脉,患者血液通过血细胞分离机,根据细胞比重和大小差异,分离患者淋巴细胞。 整个采血分离过程,约需 4 - 7 小时。收集的淋巴细胞被转移至干细胞教育器后, 可与 CB-SC 接触,通过细胞膜分子和释放的可溶性分子发挥相互作用;而其他的血 液成分自动返回到患者体内。整个治疗过程是一个封闭而连续的操作系统,患者淋巴细胞在干细胞教育器闭环系统中循环;淋巴细胞与 CB-SC 在体外进行共培养,然 后回输患者体内,整个治疗过程 8 ~ 9 小时/次。

 
图 3. 脐血多能干细胞免疫教育治疗技术(Stem Cell Educator therapy)示意图。 

图 3. 脐血多能干细胞免疫教育治疗技术(Stem Cell Educator therapy)示意图。 

 

 

四、脐血多能干细胞的免疫教育治疗分子机制

CB-SC 可能通过多种分子和细胞学机制,修复患者的免疫紊乱。当分选后患者 的免疫细胞经过教育器时,CB-SC 可通过细胞膜分子(PD-L1)和释放的可溶性分 子 (NO 和 TGF-1),形成三维调节的微环境,直接作用于 T 细胞 [3]、Treg 细 胞 [11]、病理性 T 细胞克隆 [4]、单核细胞 [12]等(图 4),产生整体的多方位 的综合调节,诱导内环境的稳定,恢复免疫平衡。

 
图 4.  脐血多能干细胞免疫调节的分子机制。当分选后患者 T 淋巴细胞经过教育器时, CB-SC 可通过细胞膜分子(PD-L1)和释放的可溶性分子 (NO 和 TGF-1),形成三维调 节的微环境,直接作用于 T 细胞 (包括调节性 T 细胞和病理性 T 细胞克隆),和单核巨 噬细胞,产生多方位的综合调节,恢复免疫平衡。单核巨噬细胞通过共刺激分子 CD86/CD80 作用于 T 细胞。通过 CPM 降解释放的因子 Arg,通过膜受体 B1R/B2R,转运 到细胞内,作为 iNOS 的底物合成 NO。释放的 NO,作为可溶性因子,参与调控。AIRE: 自身免疫调节因子; CPM:羧肽酶 M; CRH:糖皮质激素释放激素;Arg:精氨酸; B1R:激 肽 B1 受体; B2R:激肽 B2 受体; iNOS:诱导型一氧化氮合成酶; PD-L1:程序性死亡配体 1; PD-1:程序性死亡; TGF-1: 转化生长因子1. 

图 4.  脐血多能干细胞免疫调节的分子机制。当分选后患者 T 淋巴细胞经过教育器时, CB-SC 可通过细胞膜分子(PD-L1)和释放的可溶性分子 (NO TGF-1),形成三维调 节的微环境,直接作用于 T 细胞 (包括调节性 T 细胞和病理性 T 细胞克隆),和单核巨 噬细胞,产生多方位的综合调节,恢复免疫平衡。单核巨噬细胞通过共刺激分子 CD86/CD80 作用于 T 细胞。通过 CPM 降解释放的因子 Arg,通过膜受体 B1R/B2R,转运 到细胞内,作为 iNOS 的底物合成 NO。释放的 NO,作为可溶性因子,参与调控。AIRE: 自身免疫调节因子; CPM:羧肽酶 M; CRH:糖皮质激素释放激素;Arg:精氨酸; B1R:激 肽 B1 受体; B2R:激肽 B2 受体; iNOS:诱导型一氧化氮合成酶; PD-L1:程序性死亡配体 1; PD-1:程序性死亡; TGF-1: 转化生长因子1. 

 

1. CB-SC通过表达自身免疫调节因子

AIRE 通常在胸腺髓质上皮细胞中表达,调节 T 细胞的分化和发育。AIRE 通过 调控自身抗原的表达而删除自身反应性 T 细胞,诱导免疫耐受 [6,7]。如果 AIRE 基因突变或缺失,可导致多器官和系统的自身免疫性疾病。我们发现 CB-SC 表达 AIRE 基因和蛋白。为明确 AIRE 在 CB-SC 的免疫调节过程中的作用,我们采用三对 人 AIRE 特异的小分子干扰 siRNAs,以阻断 CB-SC 中 AIRE 的蛋白表达。阻断实验 证明:AIRE 蛋白表达显著下降 70%,进而导致了有助于 CB-SC 免疫调节的程序性 死亡配体-1(PD-L1)的表达水平 [13],也显著降低 [8];另外,细胞共培养中 Treg 亚群比例也显著降低。

2. CB-SC 通过纠正调节性 T 细胞(Treg)的功能缺陷

Treg 通过抑制和调节效应 T 细胞,维持动态免疫平衡和诱导自身耐受。糖尿病 患者和动物模型研究证据显示:Treg 细胞存在数量和功能异常,均与 1 型糖尿病 的发生和发展密切相关。纠正 Treg 细胞的异常,已成为预防和治疗 1 型糖尿病新 的靶点。通过研究糖尿病模型 NOD 鼠,我们观察到 CB-SC 可以纠正 CD4+CD62L+ Treg 细胞的功能缺陷,进而预防糖尿病发生,并且可逆转已发生的糖尿病 [11,14]。分 子机制研究表明:采用 CB-SC 处理的 CD4+CD62L+ Treg 细胞(mCD4CD62L Treg)治 疗后的糖尿病小鼠,能够恢复血液中 Th1/Th2/Th3 细胞因子的平衡,拮抗胰岛局部 的炎症;特别是在胰岛周围,通过转化生长因子-1(TGF-1)的独特分布格局,形 成保护性 TGF-1 分子环(‘a TGF-1 ring’), 导致浸润的淋巴细胞和其它免 疫细胞的凋亡,对抗免疫细胞的再攻击,保护新生的胰岛细胞 [11]。采用 CB-SC 免疫教育技术治疗糖尿病的临床试验中,也观察类似的结果。 治疗后,患者外周 血中 Treg 细胞的数量显著增加,且能恢复血液中 Th1/Th2/Th3 细胞因子的平衡, 特别是 TGF-1 水平显著升高 [8]。因此,CB-SC 通过 Treg-TGF1 的调节,发挥 了重要的治疗作用。


第三节 脐血多能干细胞的免疫教育临床治疗 1 型糖尿病

根据糖尿病的发病特点,糖尿病通常分为 1 型糖尿病和 2 型糖尿病;另外,还 有妊娠型糖尿病。1 型糖尿病主要与胰岛细胞的免疫损伤有关,2 型糖尿病主要 与外周器官对胰岛素的敏感性下降有关。近年来,大量的基础和临床研究表明,1 型和 2 型糖尿病在发病原因和发生机制方面,存在许多相似和交叉之处。目前,1 型和 2 型糖尿病的发病率和增长速度令人震惊,正严重地威胁人类的健康 [15]。特别是 1 型糖尿病,因患者机体免疫功能紊乱,T 淋巴细胞特异性杀伤胰 岛细胞,而导致胰岛素缺乏和糖尿病的发生。全球数以百万计 1 型糖尿病患者必 须每天注射胰岛素治疗,以维持生命。但胰岛素的治疗只能对症“治标”而不 “治本”;长期大剂量应用,具有潜在的副作用。因此,在临床实践中,如何有 效地控制 T 细胞介导的自身免疫反应,再生胰岛细胞,是治疗 1 型糖尿病亟待解决的两个关键问题。大量研究证明:1 型糖尿病的自身免疫反应具有多克隆特性, 且有多重的免疫细胞调节紊乱 [1,4]。在过去的 30 年内,为攻克 1 型糖尿病,世 界各国已对众多方案进行了探索和临床尝试,多数以失败告终。故此,针对某个单 一环节,采取传统的免疫治疗行不通。有学者建议采用联合疗法进行免疫干预,但 如何联合,何时联合,非常复杂,且会加重治疗费用 [1,15]。2014 年,国际青少 年糖尿病治愈联盟(Juvenile Diabetes Cure Alliance, JDCA)总结了 300 多项 临床研究,只有几项技术(包括人胰岛移植、猪胰岛移植、Stem Cell Educator) 有可能治愈 1 型糖尿病。其中,我们创建的脐血多能干细胞的免疫教育治疗技术 (Stem Cell Educator therapy),以全新的理念,为 1 型糖尿病的治疗开辟了先 河。

1. 临床治疗的安全性和优势

在治疗过程中,CB-SC 附着在教育器皿的表面,保留在干细胞教育器内,没有 进入患者体内,因此没有排异反应。CB-SC 通过细胞表面信号分子和释放的可溶性 分子,作用于淋巴细胞,进而达到纠正和修复患者免疫紊乱的治疗目的;CB-SC 只 在体外对患者的免疫细胞进行修复和处理,没有输入患者体内,这与传统的干细胞 治疗方案,有显著的区别。该治疗技术只需要两个静脉穿刺、感染的风险比典型输 血更低。此外,CB-SC 的免疫原性非常低,勿需进行组织配型 [2-4];根据我们目 前国际多中心的临床研究,尚未发现排斥反应。

干细胞免疫教育治疗技术适用于大多数糖尿病患者,创伤小,疼痛小,无不良 反应。但是此技术不适合于乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、结核病等病毒和细菌感 染患者。另外,出凝血机制异常、心肾功能不全患者亦属禁忌。

2. 临床治疗的有效性—纠正自身免疫

临床治疗疾病,最好针对病因。然而,1 型糖尿病的病因学研究表明:多种因 素如遗传、环境因素、肥胖等,均可诱发免疫紊乱,导致糖尿病的发生。近年来, 大量研究表明:1 型糖尿病患者存在多种细胞免疫紊乱,包括 T 细胞、B 细胞、调节性 T 细胞(Treg)、单核/巨噬细胞、树突状细胞、自然杀伤细胞(NK)、自然 杀伤性 T 细胞(NKT)等。有鉴于此,针对单一环节,采用单一的免疫干预,以纠 正 1 型糖尿病的自身免疫行不通 [16],如 CD3 单抗治疗和 GAD65 疫苗治疗,以失 败告终 [15]。理想的治疗方案,应通过诱导外周免疫耐受,调节整体免疫系统平 衡,进而达到治疗或逆转 1 型糖尿病的目的。

CB-SC 表达诱导免疫耐受的关键因子 AIRE [8]。当分离的 T 细胞经过教育器 时,CB-SC 可通过细胞膜分子和可溶性分子诱导其产生耐受,具有类似人工胸腺 (Artificial thymus)的功能。临床研究显示,1 型糖尿病患者,接受干细胞教 育器治疗后,显著提高了共刺激分子的表达(尤其是,CD28 和 ICOS),增加了 CD4+CD25+Foxp3+ Tregs 的数量,并且恢复了 Th1/Th2/Th3 细胞因子的平衡 [8]。

3. 临床治疗的有效性—纠正自身免疫记忆

生理条件下,人的免疫系统保护机体对抗多种可能遇到的病原体。 T 细胞通 过免疫应答识别和消除病原体;免疫应答完成后,大部分 T 细胞(90〜95%)发生 细胞凋亡,剩余的细胞形成中心记忆 T 细胞(TCM)、效应记忆 T 细胞(TEM)和外周 组织记忆 T 细胞(TRM)。和传统的 T 细胞比较,这些记忆 T 细胞寿命长,具有明确 的表面分子表型,可快速产生不同的细胞因子,直接效应细胞功能,不同的增殖能 力,以及独特的组织分布和归属特性。作为一个群体,记忆性 T 细胞在对付同源抗 原再次攻击时,可做出快速反应,以消除病原体的再感染,恢复免疫系统的平衡与 和谐。然而,越来越多的证据表明:在自身免疫性疾病的发生和发展过程中,自身 免疫记忆 T 细胞却成为“绊脚石”,阻碍了自身免疫性疾病的治疗或治愈,包括 I 型糖尿病、多发性硬化症(MS)、类风湿关节炎(RA)、和系统性红斑狼疮 (SLE) [17-19]。因此,克服自身免疫记忆消除自身免疫,对于治疗 1 型糖尿病 和其他自身免疫性疾病是至关重要的。

采用自体血免疫细胞教育疗法治疗白人 1 型糖尿病(n = 15),研究表明患者 接受两次治疗是安全的和可行的,没有显著改变所有受试者的免疫系统的细胞数量 和不同的细胞之间的比率(图 5A)。治疗后 T1D 受试者外周血 CD4+ TEM 和 CD8+ TEM细胞的比例显著下降(图 5B),而 CD4+ TCM 的比例升高(图 5C)。更有意义的 是,趋化因子受体 CCR7 在处女型 T 细胞(naïve T)和中心记忆性 T 细胞 TCM 的表 达水平经过治疗后显着增加 [20](图 5D)。

 
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图 5.自体血免疫细胞教育疗法纠正 1 型糖尿病患者自身免疫记忆。所有受 试者接受两次治疗。 3 个月后,所有受试者接受第二次治疗。治疗后随访分别在 2,8,12,26,40 和 56 周。采用聚蔗糖 - 泛影葡胺(=1.077)从 病人的外周血中分离淋巴细胞,然后进行流式细胞仪分析。同型匹配的 IgG 作为对照。(A)外周血免疫细胞定量分析。(B)治疗后随访 1 年观察 CD4+TEM 和 CD8+TEM 的变化。(C)治疗后随访 1 年观察 CD4+TCM 和 CD8+TCM 的变 化。(D)采用 CD45RA 和 CCR7 作为分子标志,把 CD4+ T 细胞划分为 naïve T、TCM 和 TEM。Gated CD4+ T 细胞治疗26周后 CD45RA and CCR7 的变化。

图 5.自体血免疫细胞教育疗法纠正 1 型糖尿病患者自身免疫记忆。所有受 试者接受两次治疗。 3 个月后,所有受试者接受第二次治疗。治疗后随访分别在 2,8,12,26,40 和 56 周。采用聚蔗糖 - 泛影葡胺(=1.077)从 病人的外周血中分离淋巴细胞,然后进行流式细胞仪分析。同型匹配的 IgG 作为对照。(A)外周血免疫细胞定量分析。(B)治疗后随访 1 年观察 CD4+TEM 和 CD8+TEM 的变化。(C)治疗后随访 1 年观察 CD4+TCM 和 CD8+TCM 的变 化。(D)采用 CD45RA 和 CCR7 作为分子标志,把 CD4+ T 细胞划分为 naïve T、TCM 和 TEM。Gated CD4+ T 细胞治疗26周后 CD45RA and CCR7 的变化。

 

 4. 临床治疗的有效性—控制糖代谢

通过 I 期和 II 期临床试验观察,15 例典型 1 型糖尿病患者接受了一次干细胞 免疫教育治疗。平均年龄 29 岁(从 15 岁至 41 岁),平均糖尿病病史 8 年(1 年 至 21 年)。显著提高空腹血浆 C-肽水平(图 6),降低糖化血红蛋白(HbA1C)水 平,降低胰岛素用量 (有部分胰岛β细胞功能残留的患者治疗组降低了 38%和无 胰岛β细胞功能残留的患者治疗组降低了 25%)。 该治疗在 40 周后,患者基础 C-肽和葡萄糖刺激的 C-肽水平稳步提高。然而,对照组患者(有部分β细胞功能 残留的 1 型糖尿病)起初在接受对照治疗后(教育器内没有干细胞,只是采用空的 教育器进行治疗)无显著变化 [8];后来,接受干细胞免疫教育治疗后,血浆 C- 肽水平显著提高,HbA1C 下降。

 
图 6. 1 型糖尿病患者经过自体血免疫细胞教育治疗空腹 C 肽水平的变化比较。红色线条 表示 A 组治疗前后,橘黄色线条表示 B 组治疗前后,蓝色线条表示对照组治疗前 后。 

图 6. 1 型糖尿病患者经过自体血免疫细胞教育治疗空腹 C 肽水平的变化比较。红色线条 表示 A 组治疗前后,橘黄色线条表示 B 组治疗前后,蓝色线条表示对照组治疗前 后。 

 

5. 临床治疗的有效性—刺激胰岛再生

胰岛细胞缺乏是 1 型糖尿病治疗的第二个关键问题。经过一次 CB-SC 的免疫 教育治疗后,在上述 1 型糖尿病和晚期的 2 型糖尿病患者的临床试验都提示了胰岛 细胞的再生 [8,12]。因人体研究取材受限,采用 1 型糖尿病 NOD 小鼠模型,进 一步探讨了胰岛细胞再生的分子机制。经过免疫调节治疗后,糖尿病 NOD 小鼠胰 岛局部浸润的免疫细胞发生凋亡 [11],自身免疫反应得到纠正或控制,残存的胰 岛细胞可再生 [11];在转化生长因子1(TGF-1)的作用下,可使损坏的胰岛 发生重构,恢复细胞和细胞的正常的分布结构(细胞在内和细胞分布在胰岛 外周) [11,14]。

对于晚期严重的 1 型糖尿病患者 [8],胰岛细胞几乎全部破坏,患者血浆 C 肽和胰岛素原(Proinsulin)检测不到。有意义的是,此类患者经过自体血免疫细 胞教育治疗后,临床观察也提示胰岛细胞的再生 [8](图 7)。其机制可能是启 动了患者自体内源性干细胞的分化和再生,如胰岛细胞或胰管细胞向胰岛细胞 的分化(Trans-differentiation)。另外,在成年人的外周血中,我们发现了外 周血来源的胰岛素产生细胞(Peripheral blood-derived insulin-producing cells,PB-IPC) [21]。 采用 Streptozotocin(STZ)诱导的药物性糖尿病 NOD-scid 小鼠,移植到腹腔的 PB-IPC 细胞,可通过趋化因子 SDF-1(病变的胰岛表达)和 受体 CXCR4(干细胞表达)的作用机制,潜行到胰岛;采用人的染色体探针进行原 位杂交,证明了 PB-IPC 参与了病变胰岛的重构 [21]。上述发现令人鼓舞,但有待 更精细的胰岛结构和功能研究。

 
图 7. B 组 1 型糖尿病患者经过治疗 40 周后高糖刺激 C 肽水平的比较。患者治疗前后, 通过 75 克葡萄糖口服耐量试验,检测胰岛功能的变化。蓝色线条表示治疗前,橘 黄色线条表示治疗后,糖耐量试验 2 小时的结果比较。 

图 7. B 组 1 型糖尿病患者经过治疗 40 周后高糖刺激 C 肽水平的比较。患者治疗前后, 通过 75 克葡萄糖口服耐量试验,检测胰岛功能的变化。蓝色线条表示治疗前,橘 黄色线条表示治疗后,糖耐量试验 2 小时的结果比较。 

 

第四节 脐血多能干细胞的免疫教育临床治疗 2 型糖尿病

糖尿病已成为 21 世纪世界范围内的流行病。中国糖尿病患者人数已超过1 亿;50.4%的成人处在糖尿病前期 [22]。糖尿病及并发症严重影响人类的健康和生 活质量,带来沉重的社会和经济负担。面对目前严峻的形势,尚无根治措施。常用 的人工合成胰岛素只能“治标”,而不“治本”。大量研究证明:免疫紊乱是导致 1 型和 2 型糖尿病发生的共同关键机制 [23-25]。因此,攻克 2 型糖尿病已成为亟 待解决的重要健康问题。

1. 现代医学对 2 型糖尿病发病机制的新认识:糖尿病患者存在多种免疫紊乱

胰岛素是由胰岛  细胞产生的一种激素,通过组织细胞表面的胰岛素受体, 在调节细胞的新陈代谢、增殖、分化、生存及实现动态平衡方面,发挥了关键作 用。2 型糖尿病的发生与外周组织中胰岛素受体的敏感性显著下降有密切关系,导 致组织细胞对血糖利用的下降,最终表现为临床常见的血糖水平的显著升高。肥胖 和缺乏运动是常见的增加胰岛素抵抗的危险因素。最近研究表明:脂肪细胞和巨噬 细胞分泌的炎症细胞因子,包括肿瘤坏死因子- (TNF-)、白介素-1 (IL-1)、白 介素-6 (IL-6)、白介素-17 (IL-17)、单核细胞趋化蛋白-1 (MCP-1)、抵抗素 (resistin)、纤溶酶原激活物抑制物-1 (PAI-1)等,共同参与了慢性代谢性炎症的 形成,进而通过 JNK 和(或)IKK/NF-B 信号途径,导致 2 型糖尿病胰岛素抵抗 的发生和发展。虽然 2 型糖尿病的发病因素复杂多样,但是代谢性炎症已成为最终 导致胰岛素抵抗的关键共同环节。目前抗炎治疗已成为治疗 2 型糖尿病患者胰岛素 抵抗的一种新方法。

正常生理条件下,胰岛的外周有一层基底膜,可作为屏障抵抗免疫细胞的浸 润,并协助维持动态平衡。利用人源化的免疫细胞介导的糖尿病小鼠模型,我们发 现只有通过抗原呈递细胞地启动,免疫细胞才可以穿过基底膜进入胰岛。Donath 等发现了 2 型糖尿病患者的胰岛内存在浸润的巨噬细胞。这些巨噬细胞可以提呈细胞抗原,启动免疫细胞对胰岛细胞的攻击和破坏。临床观察到部分 2 型糖尿病 具有 1 型糖尿病的血清学检查特征(自身胰岛细胞抗体),也支持这个观点。2 型糖尿病患者中,约有 10%的患者具有 1 型糖尿病相关的自身抗体,例如胰岛细胞 抗体(ICA)、抗蛋白酪氨酸磷酸酶样蛋白(IA2)、抗胰岛素和抗谷氨酸脱羧酶(GAD65) 中的至少一项检查结果呈阳性,此类患者通常被确诊为“成人隐匿性自身免疫性糖 尿病”。除了这些异常的体液自身免疫指标外,Ismail 和他的同事们发现一些胰 岛自身抗体检测呈阴性的 2 型糖尿病患者,在其外周血中有针对胰岛蛋白作出回应 的异常的 T 淋巴细胞。

大量的动物实验和临床证据表明多种免疫细胞参与了 T2D 的炎症诱导的胰岛素 抵抗,例如淋巴细胞(包括 T 细胞、B 细胞、和调节性 T 细胞 [24-28])、嗜中性 粒细胞 [29]、嗜酸性粒细胞异常 [30]、肥大细胞 [31]、和树突细胞(DC) [32,33]。特别是,B 和 T 淋巴细胞已成为启动和控制胰岛素抵抗的新靶点 [28]。 这些浸润的免疫细胞进入脂肪组织,释放细胞因子(IL-6 和 TNF),并通过 MCP- 1/ CCR2 招募更多单核细胞/巨噬细胞,浸润到脂肪组织,进而加重了肥胖相关的 炎症导致胰岛素抵抗 [28]。

为了揭示 2 型糖尿病中自身免疫发生的分子机制,我们集中研究了自身免疫调 节因子(autoimmune regulator,AIRE)。自身免疫调节因子通常在胸腺上皮细胞中 表达,在 T 细胞的分化和发育、诱导外周耐受方面发挥着重要作用。有趣的是,我 们发现人外周血多能干细胞中表达自身免疫调节因子 [23]。在体外,采用高脂肪 和高糖刺激都能显著改变外周血多能干细胞的生物活性,并且高糖刺激能够明显降 低自身免疫调节因子在这些干细胞中的表达 [23]。该发现为探讨 2 型糖尿病和自 身免疫性疾病之间的关系提供了新的分子线索。因此,代谢性炎症和自身免疫引起 的免疫紊乱是 2 型糖尿病发生的重要病理生理机制,成为 2 型糖尿病的治疗的新的 靶点。

2. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病的临床疗效——增加胰岛素敏感 性,纠正胰岛素抵抗

为探讨治疗后患者胰岛素敏感性的变化,我们检测了空腹血糖和 C 肽水平(而 不是胰岛素水平,因患者注射外源胰岛素注射),通过 HOMA-IR 稳态模型评估分析 数据表明:治疗 4 周后胰岛素的敏感性显著增加,胰岛素抵抗下降(图 8)。这表 明,胰岛素敏感性得到了改善后,胰岛β细胞功能也得以提高,患者每日二甲双胍 剂量的中位数减少 33%〜67%,平均胰岛素用量在 12 周治疗后降低了 35%。

 
图 8. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病增加胰岛素敏感性。 

图 8. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病增加胰岛素敏感性。 

 

3. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病的临床疗效——改善糖代谢 [12]

2 型糖尿病患者接受一次自体血免疫细胞教育治疗后,随访结果表明:患者平 均糖化血红蛋白(HbA1c)A 组(n = 18 例)和 B 组(n = 11)从治疗前的基础平 均水平 8.61%  1.12,4 周后显著下降为 7.9%  1.22 ( P 值= 0.026),12 周后继续下降为 7.25%  0.58(P 值= 2.62E-06)(图 9);一年后患者的患者 平均糖化血红蛋白(HbA1c)维持在 7.33%  1.02(P 值= 0.0002)。按照美国 糖尿病协会(ADA)推荐的糖化血红蛋白达标标准(<7%),在治疗后 12 周,28% (5/18)的 A 组受试糖尿病患者, 36%(4/11) 的 B 组受试者,以及 29%(2/7)C 组受试者实现了这一目标。总而言之,31%的 2 型糖尿病患者,接受一 次自体血免疫细胞教育治疗,糖化血红蛋白可达标,疗效稳定而持久可达一年以 上。

此外,根据临床疗效的评价标准:糖化血红蛋白治疗后下降超过 0.5%。在治 疗 4 周后,11/18(61.1%)的 A 组患者,8/11(72.7%)的 B 组受试者,4/7 (57.1%)的 C 组患者糖化血红蛋白值显著下降( > 0.5%)。在治疗 12 周后, 13/18(72.2%)的 A 组患者,9/11(81.8%)的 B 组受试者,和 6/7(85.7%) 的 C 组患者糖化血红蛋白值显著降低。总之,28/36(78%)的糖尿病患者,在治疗 12 周时,其糖化血红蛋白平均显著下降 1.28  0.66。该数据表明, T2D 患者经 过脐血多能干细胞免疫教育治疗后,血糖控制明显改善。 

 
图 9. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病改善糖代谢。 

图 9. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病改善糖代谢。 

 


4. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病的临床疗效——改善胰岛β细胞 功能。

胰岛素抵抗是 2 型糖尿病的特点。如果胰岛β细胞不能有效地补偿胰岛素抵 抗,最终导致临床糖尿病的发生。持久性代谢应激包括糖毒性、脂毒性、慢性代谢 性炎症、氧化应激和内质网应激,导致胰岛β细胞渐进功能障碍,并最终导致胰岛 细胞死亡和胰岛β细胞的绝对短缺。C 组糖尿病患者病程长,平均糖尿病病程 14  6 年(N =7),其胰岛功能显著下降,空腹 C 肽水平只有 0.36±0.19 ng / ml。我们发现,该组患者经过一次自体血免疫细胞教育治疗,12 周后空腹 C 肽水 平达到正常生理水平,持续而稳定升高,一年时空腹 C 肽水平保持在 1.12 ±0.33 ng / ml ,和治疗前基础水平比较,差异显著(P 值=0.00045,图 10)。
 

 
图 10. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病改善胰岛β细胞功能。 

图 10. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病改善胰岛β细胞功能。 

 

5. 自体血免疫细胞教育疗法治疗 2 型糖尿病的分子细胞免疫学机制。

为进一步明确自体血免疫细胞教育治疗 2 型糖尿病的分子和细胞机制,我们研 究患者治疗前后细胞因子及其它免疫学指标的变化。我们用 ELISA 法检查了促炎细 胞因子 IL-1,IL-6 和 TNF血浆中,其主要涉及胰岛素抵抗和 2 型糖尿病。我们发现治疗前患者的 IL-1,IL-6 和 TNF都在背景水平,经过治疗后未见显著差异(分 别为 P = 0.557、P = 0.316、P = 0.603)。其原因可能是因为入组的糖尿病患者 处于亚临床慢性代谢炎症 [34],再者是直接从 T2D 患者的血液收集,其单核细胞 没有在体外经过细菌脂多糖(LPS)活化 [35]。重要的是,我们发现,治疗后 4 周 T2D 受试者的血浆中抗炎和免疫抑制细胞因子 TGF-β1 显著增加 [12]。然而,IL- 10 是在所有的参加者治疗前后没有显著变化(P 值= 0.497)。这些研究结果表明 上调的 TGF-β1 的可能是脐血多能干细胞免疫教育治疗后,促进胰岛素抵抗逆转的 可能机制之一。

IL-17A 是参与自身免疫性疾病公认的促炎细胞因子。最近的临床研究表明在 T2D 患者 [36]和肥胖患者 [37]循环 Th17 细胞和 IL-17 的生产的增加。此外,Th1 细胞相关细胞因子 IL-12 的水平在受试者 T2D [38,39]增加。我们采用细胞内细胞 因子标记后流式细胞仪分析了,糖尿病患者治疗前后外周血白细胞介素-17(IL- 17,也被称为 IL-17A)和 Th1 / Th2 免疫应答相关的细胞因子的变化。我们发 现,T2D 糖尿病患者治疗后,外周血产生 IL-17、IL-12、和 Th2 相关的细胞因子 IL-4 和 IL-5 的水平显著下降 [12]。

内脏脂肪组织的慢性炎症是导致胰岛素抵抗的主要因素之一,其原因是脂肪组 织释放的脂肪因子(例如,IL-6、TNF、MCP-1、resistin) [40,41]。越来越多的 证据强烈地表明,巨噬细胞在代谢应激受累组织(如血管,脂肪组织,肌肉和肝 脏)的累积,已经成为在慢性代谢性炎症的导致胰岛素抵抗的关键步骤 [42] ,它 可通过释放 MCP-1 及其受体 CCR2 致使聚集和激活更多的单核/巨噬细胞浸润,产生 更多的炎性细胞因子(例如,IL-6 和 TNF),加重胰岛素抵抗。单核细胞/巨噬 细胞,作为专业的抗原呈递细胞之一,通过共刺激分子 CD80 / CD86 和释放的细胞 因子对 Th1 / Th2 细胞免疫应答发挥重要调节作用和保持动态平衡。为了证明巨噬 细胞在慢性炎症和在 T2D 胰岛素抵抗中的作用,条件性敲除 CD11c+巨噬细胞或敲除 MCP-1 信号途径可抑制巨噬细胞的浸润聚集,可显著降低肥胖小鼠的全身性炎症反 应,胰岛素敏感性显著增加 [43-45]。

为了明确自体血免疫细胞教育治疗后对 T2D 糖尿病患者血液单核细胞的调节, 我们发现 CD86 的表达水平和 CD86+ CD14+ / CD80+ CD14+单核细胞比率,经过治疗 后显著降低 [12]。 CD80 和 CD86 是两个主要的共刺激分子表达在单核细胞膜上, 通过它们的配体 CD28 / CTLA4 来调节 Th1 或 Th2 分化的免疫应答。由于表达水平 的差异,并且 CD80 和 CD86 与它们的配体 CD28 / CTLA4 之间的亲和力大小的差 异,一般认为 CD86 与 CD28 的相互作用支持共刺激信号;相反地,CD80 和 CTLA4 的 结合支持抑制性信号 [46-49]。因此,糖尿病患者经过治疗后 CD86+ CD14+ / CD80+ CD14+单核细胞比率恢复正常,有利于糖尿病患者恢复 Th1 / Th2 反应的免疫平 衡,并且具有显著的抗炎作用,进而纠正胰岛素抵抗。 


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